ذ- بعد از رسیدن نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running منبع تغذیه در ۱۰۰ میلی آمپر تا رسیدن نمونه ها به انتهای ژل ، تنظیم شود.
۳-۶-۲-۴ رنگ آمیزی کوماسی بلو :
الف-پس از ران شدن نمونه ها بر روی ژل ، اسلایدهای شیشه ای را به آرامی از ژل جدا کرده ، و یکی از ژل ها را به منظور رنگ آمیزی با محلول کوماسی بلو در ظرف پلاستیکی با حدود ابعاد ژل قرار دهید.
ب-سطح ژل را با محلول کوماسی بلو پوشانده و به مدت ۲ ساعت در دور آهسته بر روی شیکر قرار می گیرد.
پ-پس از این مدت زمان محلول کوماسی بلو را دور ریخته و ژل را با آب شستشو دهید تا رنگ های اضافی اولیه شسته شوند.
ت-سپس سطح ژل را با مقداری محلول رنگ بر پوشانده و به مدت ۲ ساعت در دور آهسته بر روی شیکر قرار می گیرد.
ث-در صورت نیاز به رنگبری اضافی ، محلول رنگ بر دور ریخته شده ، سپس محلول رنگ بر تازه اضافه گردد. این عمل تا زمانی که باندهای آبی نمایان شود و ژل دوباره شفاف شود ، ادامه داده می شود.
برای نگه داری ژل می توان از محلول استیک اسید ۷% استفاده نمود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

فصل چهارم : نتایج
۴-۱ نتایج حاصل از انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM
۴-۱-۱ نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization
در توالی نوکلئوتیدی اولیه پارامتر هایی وجود داشت که کارایی سیستم بیانی در میزبان E.coliرا پایین می اورد. در نتیجه این پارامتر ها با جایگزینی نوکلئوتید های منا سب و ایجاد کدون هایی با راندمان بالا بهینه سازی شد.در تغییرات ایجاد شده نکات زیر مورد توجه قرار گرفت:
- هیچ اسید امینه ای تغییر نکند.
- با توجه به دو قسمتی بودن پروتئین مورد نظر، تا حد امکان ساختار هر بخش پروتئینی در شکل نهایی تغییر ننماید
- قالب خواندنی^[۱۱۱] در ژن نهایی تغییر نکند.
- کدون هایی انتخاب شود که بیشترین بیان را در میزبان داشته باشد.
- پایداری mRNA مورد بررسی و توجه قرار گیرد.
- جایگاه های انزیم های محدود کننده در دو سر توالی بدون تغییر بماند.
پارامتر هایی که طی بهینه سازی دستخوش تغییر قرار گرفتند به شرح زیر می باشد :
۱) شاخص سازگاری کدون^[۱۱۲] یا ( CAI) :
از لحاظ کمی مقدار تمایل کدونی، کدون های مترادف با بهره گرفتن از شاخص سازگاری کدونی یاCAI اندازه گیری می شود که بین صفر تا یک متغیر است. زمانی که این شاخص برابر صفر باشد به این معنا ست که همه کدون های مترادف به یک میزان در یک ژن استفاده شده اند و مقدار برابر یک به معنای حداکثر بودن میزان تمایل کدونی بوده و در این مورد فقط کدون های بهینه مورد استفاده قرار گرفته اند که بالطبع آن نشان دهنده بیان بیشتر و دائم یک ژن و به عبارتی تعیین کننده سطح بیان آن خواهد بود. با توجه به این پارامتر میزان CAI برابر با یک، بهترین حالت بیانی ممکن و بیشتر از ۸/۰ ، حالت بیانی خوب و ۶/۰ ، حالت بیانی متوسط را دارا خواهند بود. در توالی اولیه طراحی شده میزان CAIبرابر با ۶۲/۰ بود که با تغییرات نوکلئوتیدی اعمال شده این میزان به ۸۸/۰ تغییر یافت. (شکل ۴-۱ )
شکل ۴-۱. شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی
بدین ترتیب میزان فراوانی کدون های بهینه^[۱۱۳](FOP ) نیز افزایش یافت به صورتی که کدون های کاملا اپتیموم برای توالی امینواسیدی در نظر گرفته شده از %۴۴ در توالی اولیه به %۶۸ در توالی بهینه شده افزایش یا فتند. دیگر کدون ها هم در بهترین حالتی که در توالی می توانستند حضور یابند به صورت بهینه در امدند. FOP اپتیموم نشان گر بیان کاملا دقیق کدون های کد کننده امینو اسید ها هستند، بدین معنی که با توجه به میزان تغییراتی که در کل توالی می تواند صورت گیرد، برای یک امینو اسید خاص، این کدون در میزبان بالاترین راندمان بیانی را می تواند داشته باشد. (شکل ۴-۲)
شکل ۴-۲ میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی
۲) شاخص محتوای G-C
میانگین محتوای G-C یک توالی مناسب بین %۳۰ تا %۷۰ ( بطور میانگین % ۵۰ ) می باشد. شاخص محتوای G-C توالی اولیه از میزان % ۱۷/۴۲ به % ۶۹/۴۷ در توالی بهینه سازی شده افزایش یافت که این امر سبب افزایش نیمه عمر mRNA ناحیه V می شود. (شکل ۴-۳ )
شکل ۴-۳. شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی.
با توجه به پارامتر های تغییر یافته، توالی ۶۲۶ نوکلئوتیدی نهایی برای ژن ناحیه vپروتئین ALCAMدر شکل ۴-۴ نشان داده شده است. همچنین در شکل ۴-۵ نیز توالی اولیه و توالی بهینه سازی شده را بطور مقایسه ای و نوکلئوتید به نوکلئوتید می توان مشاهده کرد.
شکل ۴-۴. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli.
شکل ۴-۵. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.
۴-۲ سنتز شیمیایی DNA ناحیه V
توالی طراحی شده کایمر مورد نظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد . این وکتور قبلا به نام pBMH شناخته می شد که طولی برابر با bp2907 دارد. این وکتور دارای ژن مقاومت به انتی بیوتیک امپی سیلین می باشد که می توان از ان برای جداسازی کلونی های نوترکیب استفاده کرد. طول توالی بعد از سنتز ژن به داخل پلاسمید به bp3575 رسید. توالی سنتز شده تمام مراحل کنترل کیفیت را با موفقیت گذارند. از جمله این مراحل می توان به موارد زیر اشاره کرد.
- تائید صحت توالی ژن نوترکیب
- تائید صحت توالی پلاسمید حامل
- تائید صحت شکل خواندن ( ReadingFrame ) در فرایند رونویسی
- تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ( شکل ۴-۶ )
شکل ۴-۶. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی
- تائید صحت قابلیت تکثیر ژن به کمک تکنیک PCRو عدم وجود هرگونه الودگی در ان
- کیفیت مناسب DNA سنتز شده به کمک تکنیک اسپکتروسکوپی^[۱۱۴] و عدم وجود هرگونه الودگی در ان
- شکل ظاهری شفاف و عدم وجود هرگونه ذره ی خارجی در ان
سفارش مذکور به شکل پودر لیوفیلیزه و در حجم ۱۰ میکروگرم دریافت شد و سپس بصورت استوک قابل استفاده با توجه به دستور العمل شرکت سازنده درامد. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیهVدر شکل ۴-۷ نمایش داده شده است. در این شکل جایگاه ژن مورد نظر، نحوه قرار گیری ان در پلاسمید حامل، جایگاه های انزیم های محدود کننده و همچنین جایگاه ژن مقاومت به انتی بیوتیک امپی سیلین نشان داده شده است.
شکل ۴-۷. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیهV
۴-۳ کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK حاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ارسال شده توسط شرکت تولیدی، فرایند ترانسفورمیشن برای باکتری های کامپتنت E.coli سویه Top10 انجام شد و از کلونی های رشد کرده در محیط دارای انتی بیوتیک امپی سیلین، تک کلونی انتخاب شد و سپس از تک کلونی های انتخاب شده به روش لیز قلیایی استخراج پلاسمید صورت گرفت. جهت تائید حضور پلاسمید در محلول بدست امده، الکتروفورز انجام شد. با پدیدار گشتن باند bp3575 در ژل، حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیهV پروتئینALCAM محرز گشت. در شکل ۴-۸ نتیجه حاصل از الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید نشان داده شده است.
شکل۴-۸تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهV پروتئینALCAM -از سمت راست چاهک اول نمونه پلاسمید حاوی ناحیه مورد نظر و چاهک دوم لدر DNA1kb-پیکان ابی باندbp3575 مربوط به پلاسمید حاوی ناحیه V و پیکان قرمز محل باند ۳۰۰۰bp لدر .
پس از این که وجود پلاسمید در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ناحیهV پروتئین ALCAM تائید شد، به کمک تکنیک هضم دوگانه انزیمی، وجود ژن ناحیه VپروتئینALCAM در پلاسمید، با توجه به جایگاه های انزیمی NcoI و XhoI قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. دو باند دلخواه bp662 ( ژن ناحیهV پروتئینALCAM ) و bp2907 ( پلاسمید pBSK ) نمایان گشت که تائیدی بر وجود ژن ناحیه مورد نظر در پلاسمید تکثیر شده دارد. شکل ۴-۹ نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید تکثیر یافته pBSK را نشان می دهد.
شکل ۴-۹٫ هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK حاوی ناحیه V – از سمت راست چاهک اول نمونه هضم انزیمی پلاسمید حاوی ناحیه V و چاهک دوم لدر DNA1kb –پیکان های قرمز از بالا پلاسمید (bp 2907) و ناحیه V (bp 662) –پیکان های سفید از بالا محل قرار گیری باند bp 3000 و ۷۵۰bp لدر.
۴-۴ ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM
جهت بیان ژن ناحیهV پروتئین ALCAMاز باکتری E.coli BL21(DE3)استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از ژل اگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligationبا پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد. در شکل ۴-۱۰، نقشه ژنی پلاسمید pet-28aنشان داده شده است.