در سال ۱۹۹۵ نشان‌گرهای جدیدی ابداع و معرفی شدند که به نظر می‌رسد بسیاری از محدودیت‌های نشان‌گر‌های پیشین را نداشته باشند. در این روش که AFLP نامیده می‏شود نشان‌گرهایی تولید می‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزایایRFLP مانند دقت و تکرار‌پذیری ویژگی‌های مثبت روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز را نیز دارند. پایه‌ی این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‌ها از بین تمام قطعه‌های هضم شده‌ی DNA است و سه مرحله‌ی مجزا دارد:

    1. هضمDNA با یه جفت آنزیم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌های[۳۴] اولیگونوکلئوتیدی؛
        1. طراحی، ساخت آغازگر و تکثیر انتخابی دسته‌ای از قطعه‌های حاصل از هضم .با بهره گرفتن از ردیف بازی آداپتور‌ها و نیز ردیف بازی نقاط برش، طراحی و ساخت آغازگر انجام می‌شود، اما برای تکثیر انتخابی قطعه‌های حاصل از هضم دو، سه یا چند نوکلئوتید به انتهای’۳ ردیف آغازگر اضافه می‌شود که موجب می‌گردد فقط قطعه‌هایی تکثیر‌شوند که ردیف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ی برش ،مکمل نوکلئوتیدهای یاد شده باشد؛

      ( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

    1. جداسازی قطعه‌های حاصل از تکثیر روی ژل‌های توالی‌یابی(پلی‌اکریل‌آمید) و خودپرتونگاری یا رنگ‌آمیزی نقره برای ثبت نتیجه‌ها.

با بهره گرفتن از این روش تعداد زیادی از قطعه‌های حاصل از هضم، تکثیر و قابل رویت می‌شوند. این در حالی است که نیازی به دانش اولیه در مورد توالی‌بازی قطعه‌هایی که تکثیر می‌شوند، وجود ندارند. هر یک از این قطعه‌هایی که به صورت باند روی ژل ظاهر می‌شوند، می‌توانند به عنوان یک نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند.
تعداد قطعه‌هایی که با این روش تکثیر می‌شوند، به دقت و توانمندی روش‌های جداسازی (الکتروفورز)، ثبت نتایج و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولا در این روش بین پنجاه تا صد قطعه‌ی حاصل از هضم تکثیر و با بهره گرفتن از ژل‌های پلی‌اکریل‌امید واسرشت ساز ثبت می‏شوند(۱۹)
مزایای AFLP

    • این روش در مقایسه یا سایر روش‌ها بیشترین تعدا نشان‌گر‌ها به ازای هر ژل را ایجاد می‌کند؛
    • در این روش نیازی به تهیه و تدارک و نگه‌داری کاوشگر نیست .دقت و تکرار‌پذیری این نشان‌گر به دلیل انتخاب دمای زیاد هم رشته‌سازی و اتصال آغازگر به DNA الگو بیشتر از RAPD است(۲۰).

معایب AFLP

    • پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش‌های میتنی برPCR ؛
    • عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشان‌گر‌ها؛
    • غالب بودن این نشان‌گر موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می‏گردد؛
    • تکثیر قطعه‌های غیر‌واقعی[۳۵] در AFLP موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می‏گردد(۲۰).

۱-۳-۳-۲-۲ DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی(RAPD)
در این روش از تک آغازگرهایی به طول هشت تا ده نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می‌گردد، استفاده می‏شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته‏ی DNA ژنومی می‌یابد و در آن نقاط به رشته‌های DNAمتصل می‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته‏ی مقابل به هم نزدیک باشند(فاصله‏ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. فراورده‌های واکنش PCRروی ژل آگارز از هم جدا می‏شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را درDNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه‌ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا (اضافه) شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPDمعمولا به شکل حضور و غیاب یک باند پدیدار می‏شود. بدین معنی که نشان‌گرهای RAPD از نوع غالب‌اند و افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخیص نیستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه‌های DNA مکمل با ردیف‌های آغازگرهای اختیاری (ردیف مشخص ولی تصادفی) به‌دست می‌آیند. قطعه‏های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به‌طور مستقیم روی ژل قابل مشاهده‌اند (۱۵).
مزایای RAPD

    • عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره؛
    • امکان بررسی هم زمان چندین جایگاه در ژنوم؛
    • عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ریف DNA برای ساخت آغازگر(۱۶).

معایب RAPD

    • عدم تکرار پذیری؛
    • حساسیت بسیار به آلودگی؛
    • در صورت تغییر شرایط محیطی ظهور باندهای جدید؛
    • نامعلوم بودن جایگاه نشان‌گر RAPD روی نقشه‌ی ژنتیکی(۱۶).

۱-۳-۳-۲-۳ تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)
تنوع‌ها و تفاوت‌هایی که به واسطه‏ی اختلاف در یک جایگاه نوکلئوتیدی(به علت جایگزینی، حذف یا ازدیاد) اتفاق می‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتیدی نامیده می‏شوند. این نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق می‏افتد به طوری که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز[۳۶] و گرس هوف[۳۷] (۱۹۹۸) در ژنوم انسان و اسب نشان می‏دهد که در فاصله‏ی هر دویست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتید یک SNP وجود دارد(۱۷).
با اینکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان یافت می‌شوند، ولی ایجاد و توسعه‌ی نشان‌گرهای SNP چندان آسان نیست. تهیه نشان‌گر‏های SNP شامل مراحل زیر است:

    1. تعیین ردیف DNA اطراف SNP؛
    1. تکثیر قطعه‌ای منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
    1. شناسایی SNP که شامل مشاهده‌ی دو آلل در افراد مختلف می‌باشد؛
    1. مکان‌یابی نشان‌گر SNP و تعیین جایکاه خاص کروموزومی آن؛
    1. تعیین فراوانی دو آلل در جمعیت؛
    1. بررسی SNP در افراد و ژنوتیپ‌های مختلف(۱۷).

برخی از معایب نشاگرهای SNP

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...