۹۷۸/۳

خطا ۶۰

۳۱%

ضریب تغییرات (درصد)

^٭٭- معنی‌دار در سطح احتمال ۱%
مقایسه میانگین نمودار ۲-۴ نشان داد که بین اکسین‌های مختلف بهترین نتیجه از اکسین‌های مصنوعی ۲,۴-D و NAA به‌دست آمد. در این دو هم غلظت ۱ میلی‌گرم کافی است و به غلظت‌های بالاتر احتیاج نیست و در تیمار‌های مؤثر نیز تیمار روشنایی کالوس‌زایی را کاهش داد.
اسمتا و همکاران^[۲۸۱] (۲۰۰۷) گزارش دادند که کالوس از برگ‌های باز نشده رأس ساقه نخل خرما در غلظت‌های مختلف ۲۰- ۵ میلی‌گرم در لیتر NAA مشاهده شده است. اما غلظت ۱۵ میلی‌گرم در لیتر NAA برای شروع کالوس‌زایی بهینه بوده است. همچنین استفاده ازIAA و IBAدر شروع کالوس‌زایی ریز‌نمونه برگ و همچنین تشکیل کالوس مؤثر نبوده است. غلظت نسبتاً بالای NAA در کالوس‌زایی نخل روغنی موفقیت آمیز بوده است (ودواله و همکاران^[۲۸۲]، ۱۹۹۷). بر طبق مطالعه ترم‌زی و همکاران (۲۰۱۴) تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های مختلف NAA بر روی وزن‌تر پیش‌جنین‌های کشت شده وجود دارد اما تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های مختلف بر روی کالوس‌زایی وجود ندارد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

با وجودی که از نظر کالوس‌زایی بین نور و تاریکی فرقی وجود نداشت ولی برگ‌هایی که در تاریکی قرار داشتند به همان رنگ سبز کم رنگ باقی ماندند (تصویر ۱-۴ الف) ولی برگ‌های که در نور قرار داشتند رنگ آنها به رنگ سبز تیره تبدیل شد. این تغییرات رنگی یک روز بعد از کشت قابل ملاحظه بود. برگ‌های که در نور قرار داشتند به دلیل تحریک ترشحات فنلی قهوه‌ای شدند. اما برگ‌های که در تاریکی قرار گرفته بودند این مطلب صدق نمی‌کرد (تصاویر۲-۴ ب). برگ‌های که در تاریکی قرار گرفته بود کالوس‌های به صورت تورم در لبه ‌خارجی تشکیل شد (تصاویر۲-۴ ج و د). در برگ‌های قرار گرفته در معرض نور در رگبرگ وسط کالوس مشاهده شد، طی چند هفته بعد این کالوس‌ها تولید شده قهوه‌ای و به صورت سوخته در آمدند (تصاویر۲-۴ ه). بنابراین برای تولید کالوس از ریز‌نمونه برگی استعمران استفاده از ۱ میلی‌گرم در لیتر اکسین مصنوعی ۲,۴-D و NAA بدون نور مؤثر‌تر است.
نمودار ۲-۴ مقایسه میانگین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشدی ۲,۴-D،IAA ، IBA و NAA بر جنین‌زایی سوماتیکی بر روی ریز نمونه برگ رقم استعمران. بار‌های ستون‌ها نشان‌دهنده خطای استاندارد (Estandard Error) می‌باشد.
پیش تیمار آنتی‌اکسیدانت (آسکوربیک اسید و سیتریک اسید با نسبت ۷۵:۷۵ میلی‌گرم در لیتر) به مدت ۲۴ ساعت در دمای C˚۲۵، که قبل از مرحله استریل‌کردن ریزنمونه‌های برگ خرما استفاده شد، بر روی میزان قهوه‌ای شدن مؤثر بود. با این وجود اثر آن طی واکشت‌های بعدی کاهش یافت. به همین دلیل جهت کاهش ترکیبات فنلی، زغال فعال از میزان ۱ گرم در لیتر در واکشت اول به ۲ گرم و در واکشت سوم به ۳ گرم در لیتر افزایش یافت اما دیگر ترکیبات محیط کشت ثابت‌ ماندند (عثمانی، ۲۰۰۹). استفاده از پیش‌تیمار آنتی اکسیدانت شامل آسکوربیک اسید و سیتریک اسید در مراحل مختلف از کشت، در بیشتر پژوهش‌های صورت گرفته است (حسین و همکاران^[۲۸۳]، ۱۹۹۵؛ حجازی و همکاران^[۲۸۴]، ۲۰۱۰؛ عثمانی و همکاران ۲۰۰۹).

الف
ه
ج
ب
د
تصویر ۲-۴ الف- رنگ سبز متمایل به زرد برگ‌های قرار گرفته در تاریکی، ب- قهوه‌ای شدن برگ‌های قرار گرفته در نور، ج و د- تشکیل کالوس در لبه خرجی برگ‌ها، ه- قهوه‌ای شدن کاوس‌های تولید شده در برگ‌های قرار گرفته در معرض نور
۳-۴ آزمایش سوم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP جنین‌زایی سوماتیکی ریز نمونه بساک خرما در محیط MS
بعد از ۲ هفته در محیط کشت بر روی بساک‌های کشت شده نقاط سفید رنگی ظاهر شدند که به احتمال زیاد محل تجمع توده‌های کالوسی حاصل از تکثیر میکروسپور‌ها است‌ (تصویر ۳-۴ الف). بساک‌هایی که روی محیط کشت جامد قرار داشتند به علت ترشح ترکیبات فنلی نسبت به بساک‌های کشت شده در محیط کشت مایع سیاه‌تر شدند. بعد از سه هفته در ترکیب تیماری ۲ شامل ۲,۴-D و TDZ به میزان ۵ میلی‌گرم در لیتر، اندام‌های شاخی شکل از بساک خارج شدند (تصویر ۳- ۴ ب). در ترکیبات تیماری دیگر نیز این نقاط مشاهده شدند ولی تا ۱۲۰ روز بعد از کشت پیشرفتی نداشتند. در انتهای بساک‌های که به طور کامل از پایه بساک‌ها جدا نشده بودند بعد از ۲ ماه کالوس تولید شد (تصویر ۳- ۴ ج) که احتمالاً منشأ مادری داشت و از نظر سطوح پلوئیدی با بافت بساک متفاوت است.

الف
ب
ج ا
تصویر ۳- ۴ الف- نقاط سفید رنگ بر روی بساک، ج- اندام‌زایی بر روی بساک، ب- تولید کالوس در انتهای بساک‌ها
۴-۴ آزمایش چهارم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP جنین‌زایی سوماتیکی ریزنمونه بساک در محیط کشت Y₃ مایع
بعد از ۱۰ روز در بساک‌های که بدون پیش تیمار سرمایی کشت شده بودند نقاط سفید رنگی مشاهده شد و بعد از یک ماه این نقاط واضح‌تر گردیدند (تصویر ۴-۴ الف). در بساک‌های که در یک روز بعد از اعمال تیمار سرمایی کشت شدند این مدت ظاهر شدن نقاط سفید به ۱۲ روز افزایش یافت. به طوری که در یک ماه بعد تمام ریز‌‌نمونه‌های کشت شده در ترکیبات تیماری مختلف نقاط سفید رنگ مشخص شد اما در ترکیبات تیماری که در روز پنج‌ام کشت شده بودند همه به سفید گچی تبدیل شده‌اند (تصویر ۴- ۴ ب). از طرفی در ترکیب تیماری ۷ شامل ۵ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D و ۲ میلی‌گرم در لیتر TDZو ترکیب تیماری ۱۳ شامل ۱۰ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D و ۲ میلی‌گرم در لیتر TDZ ظهور این نقاط زود‌تر اتفاق افتاد. در ۲ ماه بعد از کشت در ترکیب تیماری ۱۲ شامل ۵ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D ، ۲ میلی‌گرم در لیتر BAP و ۴ میلی‌گرم در لیتر TDZ، ترکیب تیماری ۳ شامل۱۰ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D و ۵ میلی‌گرم در لیتر TDZ، ترکیب تیماری ۹ شامل ۵ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D ، ۲ میلی‌گرم در لیتر BAP و ۴ میلی‌گرم در لیتر TDZ، ترکیب تیماری ۱۸ شامل ۱۰ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D ، ۲ میلی‌گرم در لیتر BAP و ۴ میلی‌گرم در لیتر TDZ، ترکیب تیماری ۱۵ شامل ۱۰ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D ، ۲ میلی‌گرم در لیتر BAP و ۲ میلی‌گرم در لیتر TDZ و ترکیب تیماری ۶ شامل ۱۰ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D و ۱۰ میلی‌گرم در لیتر TDZ این نقاط سفید رنگ به صورت متورم و برجسته در آمده‌اند که به احتمال زیاد محل تجمع میکروسپور‌هاست (تصویر ۴-۴ ج و د).

الف
ب
ه
و
د
ج
تصویر ۴-۴ الف- ظهورنقاط سفید رنگ برروی بساک، ب- ظهور رنگ سفید گچی در بساک‌های کشت شده در روز پنج‌ام، ج و د- ظهور نقاط برجسته و متورم در بساک‌ها، ه- تغییر رنگ‌ محیط‌های کشت در بساک‌های کاشته شده در روز‌های متفاوت، و- انتقال بساک‌ها به محیط کشت نیمه جامد.
نکته‌ی قابل توجه رنگ محیط‌های کشت است، با این که همه‌ی ترکیبات تیماری در یک روز واکشت شدند اما رنگ محیط کشت‌های که بساک‌ها در روز‌های بلافاصله بعد از برداشت و یک روز بعد از برداشت در آنها کشت شده بودند تیره‌تر بود که به احتمال زیاد ناشی از ترکیبات فنلی است. بنابراین احتمالاً پیش تیمار سرمایی در کاهش ترکیبات فنلی مؤثر بوده است (تصویر ۴-۴ ه). بعد از ۲ ماه‌ همه‌ی ترکیبات تیماری به محیط کشت نیمه جامد (۶ گرم در لیتر آگار) انتقال یافته‌‌اند (تصویر ۴-۴ و).
آندروژنسیس تنها در تعداد معدودی در گونه‌های چوبی موفقیت‌آمیز بوده است (پیکسا و همکاران، ۲۰۰۴). تاکنون نر‌زایی در نخل خرما گزارش نگردیده است و تنها مطالعات کمی بر روی کشت بساک نارگیل انجام گرفته است. به‌‌‌‌ طوری‌که کور^[۲۸۵] (۱۹۸۱) تشکیل کالوس در کشت بساک نارگیل را با فراوانی کم مشاهده کرده است. در حالی‌که یار^[۲۸۶] (۱۹۸۱) تعداد زیادی سلول پیش‌جنین که از کشت بساک نارگیل مشتق شده بودند به‌دست آورده بود. مان‌فرت^[۲۸۷] (۱۹۸۵) تعداد کمی جنین مشتق شده از بساک را به‌دست آورد که نوک ریشه و برگ‌های اولیه در آنها تشکیل شده بود، اما این ساختارها به نهال توسعه پیدا نکردند.
۵-۴ آزمایش پنجم: بررسی میزان غلظت ساکارز بر کشت بساک خرما
از ۴ غلظت مختلف (۳۰ -۶۰ -۹۰ -۱۲۰ گرم‌ در لیتر)، در غلظت ۹۰ گرم در لیتر ساکارز در محیط مایع Y₃ ظهور نقاط سفید رنگ زودتر اتفاق افتاد که با نتایج به‌دست آمده توسط پرارا (۲۰۰۸) روی نارگیل مطابقت دارد. ورمندی و ناوارو (۱۹۹۶) گزارش دادند که گرسنگی کالوس‌های دانه‌دار نقش مهمی بر روی جنین‌زایی‌ آنها دارد. آنها دریافتند بهترین شرایط برای توسعه جنین‌های سوماتیکی در کشت کالوس در محیط مایع با یک دوره ۲ هفته‌ای گرسنگی و سپس ۳ درصد ساکارز بوده است. همچنین کوزیدنی و همکاران(۲۰۰۳) گزارش دادند که استفاده از سطوح بالای ساکارز برای جنین‌زایی دانه‌ی گرده در بسیاری از گیاهان مؤثر بوده است.
۶-۴ آزمایش ششم: بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف کلشی‌سین بر روی کشت بساک
با توجه به اینکه در غلظت‌های ۱۰۰ میلی‌گرم در لیتر و ۱۰۰۰ میلی‌گرم در لیتر از کلشی‌سین هیچ گونه کالوسی تولید نشد، تجزیه واریانس با بهره گرفتن از دو غلظت ۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر و ۵۰۰ میلی‌گرم در لیتر از کلشی‌سین انجام شد (جدول ۳-۴). که نشان داد بین سطوح مختلف کلشی‌سین و نیز مدت زمان‌های مختلف قرار‌گیری بساک‌ها در معرض کلشی‌سین تفاوت معنی‌داری وجود دارد (P≤۰٫۰۱)، همچنین اثرات متقابل مورد بررسی معنی‌دار بودند. با توجه به معنی‌دار بودن اثر متقابل مقایسه میانگین فقط بر روی ترکیبات تیماری صورت پذیرفت.
مقایسه میانگین‌ها (نمودار ۳-۴) نشان داد بهترین ترکیب تیماری ترکیب ۵۰۰ میلی‌گرم در لیتر کلشی‌سین به مدت زمان ۱۲ ساعت بود (تصویر ۵-۴ الف). همچنین در ترکیب تیماری ۵۰۰ میلی‌گرم در لیتر از کلشی‌سین و مدت زمان ۳۶ ساعت جنین‌زایی مستقیم محدودی رخ داد ( تصویر ۵-۴ ب). با افزایش کلشی‌سین به ۱۰۰۰ میلی‌گرم در لیتر میزان کالوس‌زایی شدیداً کاهش یافته است که احتمالاً به دلیل اثرات سمی کلشی‌سین می‌باشد. همچنین در غلظت ۱۰۰ میلی‌گرم در لیتر کلشی‌سین کالوس‌زایی رخ نداد که نشان دهنده این است که خاصیت القاء‌کنندگی آن در این غلظت بسیار کم بود. تاکنون گزارشی از کشت میکروسپور یا بساک نخل خرما منتشر نشده بود.
در کشت بساک ذرت، غلظت ۱۰۰ میلی‌‌گرم در لیتر کلشی‌سین و مدت زمان ۳ روز بیشترین جنین‌های سوماتیکی را تولید کرده است (پورمحمدی و همکاران^[۲۸۸]، ۲۰۰۷). در کلزا بالاترین میزان باززایی در غلظت کم کلشی‌سین (۱۲۵ و ۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر) به مدت ۱۲ و ۲۴ ساعت به دست آمده است (پورمحمدی و همکاران، ۲۰۱۲).
جدول۳-۴ تجزیه واریانس تأثیر کلشی‌سین و مدت زمان بر روی کالوس زایی در کشت بساک خرما