مروری بر متون گذشته
۲-۱- اثرات انجماد روی تخمک
مطالعات نشان داده اند که انجماد تخمک ها، به طور معنی داری موجب کاهش میزان تسهیم جنین های حاصله نسبت به جنین های حاصل از تخمک های غیر منجمد می گردد (۴۱٫۵۹٪ در مقابل ۷۵٪؛
P<0.001). همچنین در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمکهای منجمد- ذوب شده، درصد بلاستوسیست ها در تخمک های منجمد بسیار کمتر از تخمک های غیر منجمد بوده است (۱۷٫۰۲٪ در مقابل ۵۴٫۲۸٪، P <0.001 )]153 [.
مطالعات مختلف حاکی از وجود آسیب های فراساختاری گوناگونی در تخمک های منجمد- ذوب شده
می باشند که موجب اختلال در زنده مانی تخمک ها، از دست دادن پتانسیل تکاملی و کاهش میزان باروری آنها می گردد. در سایر مطالعات نیز وجود تغییرات ساختاری و میکروسکوپی در تخمک های منجمد- ذوب شده گزارش گردیده است که مهمترین آنها عبارتند از: تغییر در لایه زونا پلوسیدا ]۵۱[. کاهش نفوذپذیری انتخابی غشا پلاسمایی، کاهش میکروویلی ها، بهم ریختگی گسترده اووپلاسم ]۳۱[، تغییر در میکروتوبول ها و میکروفیلامنتها ] ۳۱،۱۳۵[، بهم ریختگی دوک تقسیم، آنیوپلوییدی ]۹۱[ و تکه تکه شدن هسته ]۱۰۷[. همچنین مشاهده شده است تغییرات مذکور ممکن است با توجه به گونه حیوانی و روش انجماد مورد استفاده متفاوت باشند ]۲۴[. مشاهده شده است که انجماد تخمک ها دارای تاثیر منفی بر مقادیر رونوشت های ژنی مربوط به برخی عملکردها و پتانسیل های تکاملی جنین دارد. در واقع، میزان تسهیم و درصدتولید بلاستوسیست جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده به طور معنی داری در مقایسه با گروه کنترل کاهش می یابد ]۱۵۳[.
به منظور کاهش اثرات نامطلوب انجماد، بررسی های قابل توجهی در سال های گذشته انجام شده است که یکی از این بررسی ها کاهش حجم محلول های انجمادی اطراف تخمک به هنگام انجماد و دستیابی به حداقل حجم ضروری بدین منظور می باشد. در این راستا، وسایل مختلفی برای انجماد تخمک های تولیدی مورد استفاده قرار گرفته است که مهمترین آنها عبارتند از: شبکه های میکروسکوپ الکترونیکی ]۱۰۰[، نی کشیده باز ]۱۵۸[، کرایولوپ ]۸۰[ و اخیراً نیز کرایوتاپ ]۷۹[ که در آن حجم قطره انجماد کمتر از ۱ میکرو لیتر می باشد که بر روی یک ورق نازک پلاستیکی قرار گرفته و سپس به طور مستقیم در نیتروژن مایع قوطه ور می گردد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

لئونی و همکاران جهت بررسی کیفیت تخمک پس از انجماد به بررسی برخی ژن های دخیل در تکامل آن پرداختند که ژن های مورد بررسی عبارتند از: سوخت و ساز (N⁺a/K⁺ATPase)، تراکم و تشکیل حفره
(E-CAD)، تنظیم چرخه سلولی (cyclin B و p34cdc2)، پاسخ به استرس (HSP90β) و عملکرد متابولیک سلول (H2A.Z، PAP، یوبی کویتین، B-اکتین) است. این ژنها به عنوان مارکرهای مولکولی بررسی کیفیت، در تخمک های نابالغ و بالغ گوسفند مورد ارزیابی قرار گرفتند ]۸۷[. به عنوان مثال، کمبود E-CADمی تواند بر چسبندگی سلول ها و تراکم آنها تاثیر بگذارد ] ۱۲۸،۴۳[، و کمبود Na⁺/K⁺ ATPase ممکن است بر سوخت و ساز تخمک ]۲۹[ و جنین ]۱۷۶[ تأثیر داشته باشد. در هر صورت، به نظر می رسد روند انجماد بر قابلیت تکاملی تخمک، با تغییر در بیان ژن، یا از طریق کاهش ذخایر ترنسکریپت گامت، و یا از طریق کوتاه شدن دم پلی (A) که احتمالا به علت فقدان آنزیم PAP است، تأثیر داشته باشد ]۱۳۵[.
۲-۲- اثر روش انجماد شیشهای
در مطالعه ای، اثر روش انجماد شیشه ای بر مولکول ها، اسکلت سلولی و قابلیت رشد و نمو تخمک های نابالغ گوسفند مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه مشاهده گردید تخمک های منجمد شده در مرحله GV بیشتر از تخمک های مرحلهMII مستعد ابتلا به آسیب های ناشی از انجماد می باشند، اگرچه در تخمک های منجمد شده در مرحله MII نیز آسیب های غیر قابل برگشت مشاهده می گردد که مهمترین این موارد عبارتند از: تغییر در پلیمریزه شدن میکروتوبول ها و میکروفیلامنت ها [۱۳۷] به بهم ریختگی دوک تقسیم، آنپلوییدی[۹۱]، ناهنجاریهای کروموزومی [۱۰۶]، مرگ سلولی و کاهش قابلیت تکاملی[۱۱۲،۸۱،۸۳،۸۴،۱۲۹]. برخی از آسیب های ساختاری و عملکردی تخمک های منجمد شده در مرحله GV عبارتند از: اندازه کوچک، نقص در اتصالات بین سلول های کومولوس و تخمک، کاهش جذب اسیدهای آمینه، کاهش سنتز پروتئین، نقص در متابولیسم انرژی [۱۱۳،۸۲،۸۱] و اختلال در چرخه عوامل تنظیم کننده سلول [۸۵]. پس از لقاح نیز تخمک های منجمد شده در مرحله GV، تسهیم همراه با تأخیر، قابلیت تکاملی کمتر بلاستوسیست ها [۸۸] و کاهش میزان باروری [۱۳۵] را نسبت به تخمک های بالغ منجمد شده نشان می دهند. [۸۷،۸۵].
۲-۳- بیان زیر واحدهای پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در تخمک و جنین
پمپ Na⁺/K⁺/ATPase از دو زیر واحد تشکیل شده است؛ یک زیر واحد α کاتالیتیک که به ATP متصل
شده و دارای یک محل اتصال برای ouabain، که یک مهار کننده اختصاصی پمپ مذکور است و یک زیر واحد زیر واحد β غیر کاتالیتیک و گلیکوزیله که دارای نقش ساختاری بوده و برای قرار دادن زیرواحد α داخل غشاء پلاسمایی ضروری است، می باشد] ۵۰،۱۵۷،۱۳[. هر دو زیر واحد برای کدگذاری یک خانواده چند زیر واحدی، با چهار ژن زیرواحد α (_۱α، _۲α، _۳α، _۴α) و سه ژن زیرواحد β (_۱β، _۲β، _۳β) هستند]۶،۱۳[. همچنین گزارش شده است که یک زیر واحد سومی، تحت عنوان زیرواحد γ، که با جایگاه ouabain مرتبط شده است نیز وجود دارد، و ممکن است در تعدیل فعالیت پمپ مذکور نقش داشته باشد ]۶۸[.
هر زیر واحد در جنین، بیان الگوی مکانی و زمانی مجزا دارد ] ۶۸،۱۷۳،۱۷۵[. بیان ژن برخی از ایزوفرم های پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در موش مطالعه شده و مشاهده گردیده است که mRNA ایزوفرم های _۱α، _۳α، _۲β و _۳β در طول تکامل جنین قبل از لانه گزینی بیان شده اند ]۱۷۵[.
رونویسی از ایزوفرم _۲α در تخمک دیده شده، لیکن در مرحله پیش از لانه گزینی جنین این ایزوفرم دیده
نمی شود ]۹۷[، رونویسی از mRNA مربوط به ایزوفرم _۱β در زایگوت مشاهده شده است، بدین ترتیب که در مراحل دو تا هشت سلولی وجود نداشته و مجدداً در مراحل مورولا و بلاستوسیست بیان می شود ]۱۷۵[، در نهایت، مشاهده شده است که رونویسی از زیرواحد γ در تخمک و در مرحله جنینی، از اواسط مرحله هشت سلولی تا مرحله بلاستوسیست صورت می گیرد ]۶۸[. اگر چه چندین زیر واحد از mRNA ایزوفرم های Na⁺/K⁺/ATPase در تمام مراحل تکاملی جنین های پیش از لانه گزینی در موش بیان شده است، لیکن فقط ایزوفرم های _۱α و _۱β محدود به غشاء بازولترال تروفکتودرم می باشند. ایزوفرم های _۳α، _۲β و _۳β، در غشای پلاسمایی و در تمام مرحله بیان شده اند ]۹۷[. همچنین، زیرواحد γ از مرحله هشت سلولی در نوحی رأسی و بازولاترال سلول ها بیان شده است ]۶۸[.
در جنین گاو، mRNA مربوط به ایزوفرم های _۱α، _۲α، _۳α، و _۲β از مرحله زایگوت تا مرحله بلاستوسیست بیان شده اند و رونویسی از ایزوفرم _۱β تنها در مراحل مورولا و بلاستوسیست مشاهده گردیده است. رونویسی از ایزوفرم _۴α در هیچ یک از مراحل پیش از لانه گزینی مشاهده نگردید ]۱۰[. با بهره گرفتن از تکنیک های ایمونوفلورسانس، مشاهده گردید زیرواحدهای _۱α و _۳α پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در حاشیه سلول، از مرحله زایگوت تا مرحله مورولا در جنین گاو بیان شدند ]۹[، در مرحله بلاستوسیست، زیر واحد _۱α، در نواحی بازولترال تروفکتودرم محدود می باشد، لیکن در حاشیه تمام سلول های ICM (توده سلولی داخلی) بیان می شود. در مقایسه، زیرواحد _۳α، در نواحی رأسی تروفکتودرم محدود بوده و در ICM دیده نمی شود ]۹[.
۲-۴- پمپ /k⁺ ATPase Na⁺
در رویان در حال تکوین سلولهای بیرونیتر نواحی راسی و غشای پایهای- جانبی برای انتقال یونهای اختصاصی هستند و در غشاهای راسی و پایهای- جانبی پمپهای /k⁺ ATPase Na⁺ متمرکز شدهاند. پمپ /k⁺ ATPase Na⁺ با فعالیت خود یونهای Na⁺ و Cl^- را به فضای بین سلولی منتقل میکند و یک گرادیان اسمزی به وجود میآورد که سبب میشود مایعات به بین سلولها کشیده شود و در مورولا تجمع پیدا کند (شکل۲-۱).
با تجمع مایعات، سلولهای بیرونیتر پهن و کشیده میشوند و حفرهای در وسط رویان ظاهر میشود که بلاستوسل نامیده میشود. اتصالات شکافدار سبب میشوند سلولهای درونیتر به یک قطب کشیده شوند. در نتیجه دو دسته سلول در رویان قابل تشخیص خواهد بود که سلولهای ترفکتودرم و سلولهای توده داخلی یا امبریوبلاست[۶] هستند (شکل۲-۱). سلولهای ترفکتودرم که سلولهای پهن پیرامونی هستند جفت و غشاهای جنینی را میسازند و سلولهای توده داخلی جنین را بوجود میآورد. آنزیم /k⁺ ATPase Na⁺ از دو زیرواحد α و β تشکیل شده است زیرواحد α کاتالیتیک بوده و زیرواحد β سبب میشود که آنزیم در موقعیت صحیح در غشا قرار گیرد [۹۷]. زیرواحد α چهار ایزوفرم (_۱α،_۲α، _۳α، _۴α) و زیرواحد β سه ایزوفرم دارد [۹]. گاهی اوقات زیرواحد سومی به نام γ با آنزیم /k⁺ ATPase Na⁺ نیز در ارتباط است [۱۷۴]. نحوه عملکرد آنزیم /k+ ATPase Na+ برای تشکیل بلاستوسیست در گونههای مختلف متفاوت است. برای مثال برخلاف رویان گاو، رویان موش mRNAهای_۲ α /k⁺ ATPase Na⁺ و _۳α /k⁺ ATPase Na⁺ را که در غشای پایهای جانبی و راسی ترفکتودرم قرار میگیرند بیان نمیکنند [۱۱۴]. اطلاعات بدست آمده از نقش/k⁺ ATPase Na⁺ در تشکیل بلاستوسیست عمدتاً از به کارگیری مهارکننده آن یعنی اوبائین^[۷۹] حاصل شده است [۴]. ایزوفرم _۳α در تشکیل بلاستوسیست در گاو نقش اصلی را بر عهده دارد. رویانهای گاوی نسبت به رویانهای موشی حساسیت بیشتری به اوبائین دارند و این نشان میدهد که ایزوفرم _۳α نسبت به _۱α حساسیت بیشتری به اوبائین دارد [۴]. فعالیت آنزیمی /k⁺ ATPase Na⁺ در همه گونه ها درست قبل از تشکیل بلاستوسیست افزایش مییابد [۶۳].
۲-۵- آکواپورینها
آب به روش های مختلف از میان سلولهای ترفکتودرم رویان عبور میکند که عبارتند از: ۱) انتشار ساده، ۲) انتقال تسهیل شده توسط آکواپورین^[۸۰] (AQP) یا کانالهای آب (شکل ۲-۲)، محصول جانبی فعالیت همانتقالی انتشار یک روش موثر در انتقال آب است اما بستگی به شدت شیب اسمزی دارد. ممکن است AQPها در تسهیل انتقال آب هنگام تشکیل بلاستوسیست مهم باشند [۱۲۰]. بیش از هفت mRNA، که آکواپوینها را کد میکنند در رویان موش شناسایی شدهاند. با به کارگیری مهارکنندههای AQPها مشخص شده است که AQPها نقش وظیفهای دارند [۱۴۳]. بنابراین وجود AQPهای وظیفهای در غشا ترفکتودرم عامل زندهمانی رویان موشهای فاقد ایزوفرم _۱α /k⁺ ATPase Na⁺ است. گزارش شده است که رویان موشهایی که فاقد ایزوفرم _۱α/k⁺ ATPase Na⁺ هستند میتوانند تا قبل از لانهگزینی بدون مشکل تکوین پیدا کنند [۱۱۰]. این نتایج نشان میدهند که ممکن است در موش وجود/k⁺ ATPase Na⁺ برای تشکیل بلاستوسیست ضروری نباشد.
۲-۶- هچ یا تفریخ
مادامی که بلاستوسیست در حال تقسیمات میتوزی است مایعات به داخل حفره بلاستوسیست وارد میشوند و فشار داخل رویان افزایش مییابد و رویان به حداکثر اتساع میرسد. همزمان با رشد رویان و تجمع مایعات، آنزیمهای پروتئولیتیک توسط سلولهای ترفکتودرم تولید میشود که از درون سبب ضعیف شدن دیوارۀ زوناپلوسیدا میگردد. بلاستوسیست نیز با انقباضات مکانیکی خود باعث افزایش فشار درونی میگردد. هنگامی که شکاف کوچکی در زونا ایجاد میشود سلولها خود را با فشار به بیرون از زونا میکشند تا از حصار زونا آزاد شوند. در بلاستوسیست انقباضات مکرری پس از تشکیل بلاستوسل رخ میدهد و تکرار این انقباضات در زمان هچ شدن بیشتر از زمان های قبل و بعد از هچ میباشد. در حوالی روز ۵ در انسان و روز ۸-۶ گاو و گوسفند بلاستوسیست از زونا آزاد میگردد که به آن جازه رشد بیشتر، دستیابی به مواد مغذی و ترشحات رحمی و لانه گزینی میدهد. هرگونه اختلال در تنظیم فرایند هچ سبب میشود که لانهگزینی رخ ندهد و در نتیجه ناباروری ایجاد گردد [۱۲۴]. کنترل فرایند هچ و هضم زوناپلوسیدا توسط بیومولکولها و فاکتورهای سلولی مختلف صورت میگیرد [۱۳۹]. اطلاعات کمی در مورد سازوکار این پدیدۀ تکوینی مهم وجود دارد. در بلاستوسیستی که به طور پیشرونده در حال اتساع است، فشار هیدروستاتیک سبب ایجاد یک شکاف کوچک در زوناپلوسیدا میشود، علاوه بر آن هم بلاستوسیست و هم اندومتریوم فاکتورهایی ترشح میکنند که در فرایند هچ دخالت دارند [۵۷]. همچنین در بلاستوسیست آماده هچ زواید تروفکتودرم^[۸۱] TEPs ظاهر میشود. TEPs به همراه چندین فاکتور تنظیمگر سلولی و مولکولی مربوط به هچ سبب وقوع هچ میشوند (شکل۲-۳).
نشان داده شده است که TEPs زونا را در قطب غیررویانی^[۸۲] سوراخ میکند و طی سوراخ شدن، زونا حرکات موجی از خود نشان می دهد [۱۴۷]. همچنین از سلولهای ترفکتودرم زوایدی که منشا آنها اکتین اسکلت سلولی است خارج میشود که فیلوپودیا^[۸۳] نامیده میشود که به توده سلولی داخلی وارد میشود و در انتقال پیام سلولی نقش دارد [۶۲]. TEPs و فیلوپودیا به همراه تنظیمگرهای مولکولی هچ باعث آزادسازی بلاستوسیست از حصار زونا میشوند. تنظیمگرهای مولکولی که هچ را تحت تاثیر قرار میدهند، یکی از مهمترین جنبه های فرایند هچ است. فاکتورهای امبریوتروفیک^[۸۴] مثل فاکتورهای رشد، سیتوکینها، فاکتورهای نسخهبرداری، سیستئین پروتئازها نمونههایی از این تنظیمگرها هستند [۱۳۹]. مطالعات نشان داده است که EGF^[85]، EGF متصل شونده به هپارین^، [۸۶]TGF-β و ^[۸۷]LIF، سبب تسریع هچ میشود [۱۳۹]. مهار رسپتورهای آلفای استروژنی (ER-α) توسط آنتاگونیست ICI 182,780، نشان داد که هچ شدن بلاستوسیست همستر بهطور برگشتپذیری مهار میشود. این مطالعه نشان می دهد که ER-α میتواند در فرایند هچ نقش تنظیمی داشته باشد [۱۴۷]. همچنین دیده شده است که مهار COX-2^[88] و NFκB^[89] به شدت فرایند هچ را تحت تاثیر قرار میدهد [۱۴۷]. در حمایت از این یافته دیده شد که PGI2 که محصول فعالیت COX-2 است برای هچ شدن رویان موش بسیار حیاتی است [۲۵]. گروه های مختلفی از پروتئازها (مثل سرین و سیستئین یا متالو پروتئاز) بسته به گونه، در فرایند هچ دخالت دارند [۶۴]. اختلال در فعالیت پروتئازها منجر به عدم آبستنی میشود. نشان داده شده است که مهارکنندههای پروتئازهای سیستئینی مانند آنتیپاین^[۹۰]، لئوپپتین^[۹۱]، پی- هیدرومرسیوری بنزوات^[۹۲] مانع از هچ شدن بلاستوسیستهای کشت شدهی همستر در in vitro میشود بدون آنکه تکوین رویانها را تا مرحله بلاستوسیست تحت تاثیر قرار دهند [۶۴]. مطالعات اخیر نشان دادهاند که کاتپسینهای مشتق شده از بلاستوسیست در هچ و هضم زونا نقش دارند [۶۴]. نشان داده شدهاست که زونای موش حساسیت کمتری نسبت به همستر به هضم توسط پروتئازها دارد، که نشان میدهد ممکن است ترکیبات زونا و یا ساختار آن بین گونهها متفاوت باشد [۴۲]. شناخت بیشتر سازوکار فرایند هچ در پستانداران نیازمند مطالعات بیشتر است. نتایج ارزیابی پروتئوم و ترانسکریپتوم رویانهای در حال هچ در آینده میتواند شناخت ما را از سازوکار پدیدهی هچ بیشتر کند.
۲-۷- فعال شدن ژنوم رویانی
دوره پس از لقاح رویان پستانداران با چندین فرایند انتقالی مهم تکوینی همراه است. اولین و شاید مهمترین آنها فعال شدن ژنوم رویانی^[۹۳] است، که در آن ترانسکریپتهای ژنوم رویانی بیان میشود و جایگزین ترانسکریپتهای مادری میگردد. در این مرحله محتوای ژنوم جنین فعال گشته و با تکیه بر mRNAs های حاصل از ترجمه ژنوم خودی به تکوین خود ادامه میدهد. هدف این تغییر بزرگ تبدیل تخمک به یک بلاستومر توتیپتنت^[۹۴] است. در گونه ها و حتی در نژادهای مختلف، این رخداد در مراحل مختلف تکوین (چهارمین گامه تقسیم سلولی در گاو، پنجمین گامه در خرگوش، گامه سوم تا چهارم در انسان، دومین گامه در موش و چهارمین گامه در گربه) اتفاق میافتد.
mRNA مادری و پروتئین ذخیره درون اووسیت با گذشت زمان کاهش مییابد به طوریکه نهایتاً در طی سومین تا چهارمین گامه سلولی این ذخایر مادری کاهش خواهد یافت. اووسیت توانمند بایستی حاوی مقادیر
کافی mRNA مورد نیاز برای تکوین جنینی تا چهارمین و پنجمین گامه سلولی باشد. در این مرحله است که فعال شدن اصلی ژنوم جنین اتفاق افتاده و فعالیت نسخهبرداری افزایش و سنتز پروتئین آغاز میشود (شکل۲-۴). [۶۵] مطالعات گسترده اخیر حاکی از نقش حیاتی توالیهای خاص ژنوم جنین در القا فعالسازی سرتاسری ژنوم جنین میباشد. براین اساس ژنهای مختلفی در گونه های مختلف پستانداران تشخیص داده شدهاند به طوریکه اکنون ژنهای زیادی کاندید اکتیواسیون ژنوم جنینی شناخته شدهاند.
۲-۸- متابولیسم رویان
چرخه کربس منبع اصلی تامین انرژی رویان از مرحله زایگوت تا مرحله قبل از لانهگزینی است. تا قبل از تشکیل بلاستوسیست میسر گلیکولیز در رویان فعالیت خیلی کمی دارد اما در شروع تشکیل بلاستوسیست توانایی گلیولیز به شدت افزایش مییابد. مصرف اکسیژن نیز در مراحل اولیه تقسیم رویانی پایین است و با تشکیل بلاستوسیست بالا میرود تا ATP لازم برای پمپ /k⁺ ATPase Na⁺ برای تشکیل حفره بلاستوسل و ساخت پروتئین برای رویان در حال رشد طی چرخه کربس تامین شود. در مرحله بلاستوسیست فرایند بیهوازی گلیکولیز به راه میافتد تا نیاز متابولیکی بلاستوسیست در حال رشد و تشکیل حفره بلاستوسل را فراهم سازد. این موضوع به کمک برخی پروتئینهای غشایی سرتاسری یا اینتگرال که ناقلهای گلوگز^[۹۵] ((GLUTs هستند انجام میگیرد. رویان در روزهای اولیه بدون نیاز به گلوکز قادر است تقسیمات خود را ادامه دهد، اما بعد از مرحله مورولا به مقدار جزیی گلوکز نیاز دارد. گلوگز علاوه بر اینکه به عنوان سوبسترای انرژی به کار میرود، اکسیداسیون آن در مسیر پنتوز فسفات نیز سبب تولید قند ۵ کربنه ریبوز میشود که پیشساز ساخت DNA و RNA در رویان میباشد. گزارش شده است که وجود مقدار جزیی گلوکز برای بیان GLUT3 لازم است. GLUT3 در تشکیل بلاستوسیست نقش دارد. همچنین گزارش شده است که گلوکز برای بیان ناقلهای منوکربوکسیلات [۱۳۱] که مسئول انتقال جفت شده پروتون با یک آنیون مثل پیروات و لاکتات است و در تنظیم ^[۹۶]PHi نقش دارند لازم است [۴۹]. گلوکز علاوه بر سوبسترای انرژی به عنوان یک عامل در سیگنالینگ سلولی نقش ایفا می کند [۱۳۳].
بیانGLUT1 از مرحله زیگوت تا مرحله بلاستوسیست و بیان GLUT3,4 از مرحله ۸ سلولی تا مرحله بلاستوسیست رخ میدهد. GLUT4 بیان نمیشود و GLUT8 در مرحله بلاستوسیست بیان میشود. مطالعات نشان داده است که GLUT8 در موش پس از تحریک با انسولین تنظیم افزایشی^[۹۷] پیدا میکند، اما تحقیقات جدیدتر نشان دادهاند که در غیاب GLUT8 تکوین رویانی به طور طبیعی رخ میدهد. فعالیت متابولیکی رویان میتواند پیشبینی کنندۀ قدرت زندهمانی آن پس از انتقال به گیرنده ها باشد. شرایط مختلف کشت رویان، فعالیت متابولیکی آنرا تحت تاثیر قرار میدهد. میزان جذب گلوکز و متابولیسم آن در رویان با قدرت تکوین آن ارتباط دارد و به احتیاجات رویان مربوط میشود [۳۴،۱۳۴]. نیاز به انرژی برای فعالیت پمپ Na⁺/K⁺ ATPase در شروع تشکیل بلاستوسیت نمونهای از این احتیاجات است[۳۳]. دیده شده است که شرایط کشت میتواند توانایی رویان را برای متابولیسم نمودن گلوکز تحت تاثیر قرار دهد[۷۶،۱۴۱،۴]. در رویانهایی که هنگام همکشتی با سلولهای اپیتلیال اویداکت تولید میشوند میزان متابولیسم گلوکز بالاست اما تعداد سلولهای رویانی کمتری دارند و زمان تکوین در آنها به تاخیر میافتد. پیشنهاد شده است که مصرف میزان بالای گلوکز ممکن است به زنده مانی کم رویان مربوط شود[۷۶]. همچنین دیده شده است که وجود سرم در محیط کشت رویان سبب افزایش فعالیت گیکولیتیک رویان میشود و رویانها ظاهری تیره و گرانوله دارند [۱۵۶].
۲-۹- نقش آلدوسترون در بیان پمپ Na⁺/K⁺ ATpase
در یک مطالعه، الیورا (Olivera et al., 2000) به بررسی تأثیر آلدوسترون بر پمپ Na⁺/K⁺/ATPase و متعاقباً کاهش ادم ریوی موش های صحرایی پرداخت. بدین ترتیب پس از جدا سازی و تخلیص سلول های آلوئولی
تیپ II، آنها را به مدت ۳، ۶، ۱۲ و ۲۴ ساعت در غیاب و حضور آلدوسترون به میزانnM 300 کشت داد. نتایج این مطالعه نشان داد آلدوسترون موجب افزایش یکنواخت مقادیر mRNA مربوط به تحت واحد β_۱ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، نیز مقادیر پروتیین Na⁺/K⁺/ATPase و نیز افزایش سلول های آلوئولی تیپ II در زمان های ۱۲ و ۲۴ ساعت پس از کشت می گردد ]۱۱۶[.
افزایش فعالیت Na⁺/K⁺/ATPase احتمالاً ناشی از تغییر در فعالیت پمپ های Na⁺/K⁺/ATPase موجود، به کارگیری یا تغییر موقعیت پمپ های مذکور از منابع داخل سلولی به غشای بازولترال و یا متعاقب نسخه برداری یا ترجمه که موجب افزایش تعداد پمپ های فعال Na⁺/K⁺/ATPase بر روی غشای پلاسمایی سلول می گردد، می باشد ]۸،۴۷[. در این مطالعه آلدوسترون هیچ تأثیری بر روی مقادیر mRNA تحت واحد _۱α پمپ Na⁺/K⁺/ATPase نداشت، در حالی که مقادیر پروتیین های تحت واحد مذکور را در غشای بازولترال سلول ها افزایش داد. بدین ترتیب به نظر می رسد آلدوسترون به منظور افزایش فعالیت پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، از مکانیسم های متفاوتی جهت تنظیم تحت واحدهای α و β استفاده می نماید؛ به عنوان مثال آلدوسترون میزان نسخه برداری و ترجمه تحت واحد β را تغییر می دهد، در حالی که احتمالاً در مورد تحت واحد α، از به کار گیری منابع داخل سلولی برای غشای بازولترال استفاده می نماید ]۸،۴۷[.
در مطالعات دیگر نشان داده شده است که تأثیر آلدوسترون بر مقادیر mRNA تحت واحدهای α و β در سلول های کشت داده شده مختلف، متفاوت است؛ به عنوان مثال مواجهه سلول های قلبی موش صحرایی با آلدوسترون، موجب افزایش سه برابری در مقادیر mRNA تحت واحد α در مدت ۶ ساعت گردید ]۵۸[. در مطالعه دیگر در سلول های کلیوی کشت داده شده (A6)، آلدوسترون موجب افزایش ۵/۲ برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱β گردید، لیکن هیچ تأثیری بر مقادیر mRNA تحت واحد _۱α پس از ۳ ساعت مواجهه نداشت ]۹۰[.
در مطالعه ای که وری (Verrey et al., 1989) به منظور بررسی تأثیر آلدوسترون بر روی نسخه برداری ژن مربوط به Na⁺/K⁺/ATPase در سلول های کلیوی انجام داد، نشان داد که افزودن nM300 آلدوسترون در محیط کشت سلول های A6 کلیوی در طول ۶ ساعت موجب افزایش ۴ برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱β و نیز افزایش دو برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱α پمپ مذکور گردید. در این مطالعه پیشنهاد شده است که احتمالاً آلدوسترون با تأثیر مستقیم بر روی ترکیب هورمون-گیرنده و تحریک پروموتر ژن Na⁺/K⁺/ATPase موجب افزایش نسخه برداری و مقادیر mRNA ژن مذکور می گردد ]۱۶۵[.
در مطالعه دیگری اگوچی (Oguchi et al., 1993) به بررسی تأثیر آلدوسترون بر بیان ژن Na⁺/K⁺/ATPase در سلول های عضلات صاف عروق پرداخت. نتایج این مطالعه بیانگر افزایش ۳/۲ برابری در مقادیر تحت واحد _۱α و افزایش ۷/۴ برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱β پس از ۲۴ ساعت کشت گردید که احتمالاً بیانگر تحریک بیان ژن Na⁺/K⁺/ATPase در محیط کشت سلول می باشد ]۱۱۵[.
فصل سوم
مواد و روش کار
انجام این مطالعه مستلزم تولید جنین‌های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF) به منظور اخذ بلاستوسیست از آن‌ها و بررسی تأثیر آلدوسترون بر روی تکامل جنینها بعد از مورولا تا بلاستوسیست و بررسی بیان پروتیین Na⁺/K⁺ ATpase میباشد.
جمع‌ آوری تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مایع فولیکولی
بلوغ آزمایشگاهی تخمک‌ها (IVM)
آماده سازی اسپرم به منظور IVF
آماده سازی COC ها به منظور IVF
لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF)
کشت داخل آزمایشگاهی جنین ها (IVC)
تازه کردن محیط کشت جنین ها (refresh)
۳-۱- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)
۳-۱-۱- جمع‌ آوری تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مایع فولیکولی
پس از جمع‌ آوری تخمدان‌ها از گوسفندهای کشتار شده درکشتارگاه، ظرف مدتی کمتر از ۳ ساعت تخمدان‌ها با بهره گرفتن از فلاسک حاوی سرم فیزیولوژی به همراه آنتی‌بیوتیک (mg/ml strep200 IU/ml pen & 0.2) در دمای ۳۰-۲۰ درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه منتقل می‌شوند. در آزمایشگاه تخمدان‌ها چند بار با آب شهری با همان درجهای که تخمدانها دارند شستشو داده شده و سپس داخل بشر حاوی سرم فیزیولوژی ریخته شده و در بن ماری ۳۰ درجه سانتی‌گراد قرار می‌گیرند. اووسیتها از فولیکولهای آنترال با قطر ۶-۲ میلیمتر، به روش آسپیره کردن، با کمک پمپ خلاء، و با بهره گرفتن از سوزن شماره ۲۱ گرفته شد. محتویات فولیکولهای آسپیره شده درون لوله فالکون ۵۰ میلیلیتری که حاوی مقداری محیط آسپیراسیون گرم بود جمعآوری میشد، تمام مراحل استحصال اووسیتها از فولیکول در داخل بنماری با ۳۰ درجهسانتیگراد انجام گرفت. مایع آسپیره شده ۱۰ دقیقه جهت رسوب ذرات، بی‌حرکت گذاشته شده سپس رسوب ته لوله با پیپت پاستور کشیده و داخل پتری دیش استریل و خط‌کشی شده ریخته می‌شود.