جهت آشکارسازی محصول PCR از روش متداول و سریع الکتروفورز ژل آگاروز و رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید برای آشکارسازی سکانس هدف تکثیر یافته استفاده می‌کنیم.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

آگارز پلی ساکاریدی است که در اثر حرارت در بافر مناسب خود به صورت‌ ژله‌ای با آرایش پلیمری منظم و قطر منافذ مشخص در می‌آید. این منافذ امکان عبور ماکرومولکول‌های DNA را در ژل آگاروز حین انجام الکتروفورز از قطب منفی (کاتد) به سمت قطب مثبت (آند) فراهم می‌کند. غلظت بالاتر ژل آگاروز سبب ایجاد منافذ ریزتر می‌شود که قدرت تفکیک اندازه ‌DNA کوچکتری را فراهم می‌کند.
با دانستن طول سکانس هدف، غلظت ژل آگاروز را برای بررسی محصول PCR خود تعیین کرده و ژل مناسب را تهیه نمودیم.
حدود ۶ میکرولیتر از نمونه‌ها با ۵/۱ میکرولیتر از بافر لود کننده با غلظت ۶ شرکت سیناژن، به خوبی مخلوط گردیده و در چاهک‌های ژل قرار داده می‌شدند.
جهت بهینه نمودن الکتروفورز، این عمل در حالات و شرایط مختلف آزمایش گردید. بدین منظور انواع آگاروز از شرکت‌های خارجی از جمله Gibco BRL, Bio Rad, Digma, Roche هم چنین انواع بافرها با غلظت‌ها و نسبت‌های مختلف مواد تشکیل دهنده آن‌‌ها، اختلاف پتانسیل و شدت جریان‌های مختلف، منابع تغذیه ولتاژ تانک‌های مختلف الکتروفورز و تانک‌های مختلف الکتروفروز و هم چنین زمان‌های مختلف الکتروفورز مورد ارزیابی و بررسی قرار گرفتند، که بهترین حالت با ژل آگاروز با غلظت ۵/۱ درصد حل شده در بافر TBE (5X) و بافر تانک TBE(1X)، اختلاف پتانسیل ۸۰ ولت و به مدت ۱ ساعت با دستگاه الکتروفورز شرکتBio Rad حاصل آمد.
۳-۷-مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز
۳-۷-۱-ژل آگارز
۳-۷-۱-۱-طرز تهیه ژل آگاروز
درصد ژل مورد استفاده در این تحقیق ۵/۱ درصد بوده با توجه به درصد ژل، میزان پودر آگاروز را محاسبه نموده و پس از وزن کردن، پودر را بسته به نوع تانک (بزرگ و یا کوچک بودن) با میزان مناسب از بافر TBE(1X) در داخل بشر مخلوط کرده و بر حسب نوع استفاده با درصد خاص ۵/۱ به ترتیب به میزان ۵/۱گرم از پودر آگاروز با ۱۰۰سی‌سی بافر(۱X) TBE مخلوط گردیده و پس از مخلوط کردن پودر آگاروز در بافر TBE1 X، آن را در مایکروویو قرار داده و پس از شفاف شدن محلول و رسیدن دمای آن به ۵۰-۴۵ درجه سانتیگراد سپس شانه را در داخل آن قرار داده، باید به دقت به داخل قالب ریخته ‌شود و تا سرد شدن کامل ژل صبر نموده تا زمانی که ژل حالت شیری رنگی را پیدا نماید.
۳-۷-۱-۲-تهیه بافر الکتروفورز
محلول EDTA
Buric acid
Tris base (TBE-5X)
محلول ذخیره ۵ بار غلیظ TBE(5X) به صورت زیر تهیه و در زمان مصرف با آب مقطر رقیق شد. ابتدا ۷/۳ گرم EDTA را به همراه۵۴ گرم از تریس بیس و ۵/ ۲۷ گرم از بوریک اسید را وزن کرده و با آب مقطر به حجم ۹۰۰ میلی لیتر می‌رسانیم. pH آن را روی ۸ تنظیم نموده و به حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر رساندیم.
۳-۷-۱-۳-بافر سنگین کننده (۱۰x Sample bading Buffer)
این بافر سنگین کننده محلول است تا از درون چاهک ژل خارج نشود و از طرفی می‌توان محل محصولات PCR را بوسیله رنگ بروم فنل بلو که در جلو حرکت می‌کند را مشاهده کرد. ۶ میکرولیتر از محصول PCR را با ۵/۱ میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط کرده و به آرامی توسط سمپلر درون چاهک ژل تخلیه گردید.
مارکرمولکلی(DNA Lader )مورد استفاده
مارکر مورد استفاده در این تحقیق ۱۰۰۰ DNA Lader bp ساخت شرکت Viogene با فاصله ۱۰۰ جفت باز از وزن ۱۰۰ وزن ۳۰۰۰ جفت باز بود که برای مشخص کردن طیف گسترده‌ای از باندها با اندازه‌های مختلف وزن مولکولی تعبیه شده است.
۳-۷-۱-۴-رنگ آمیزی ژل:
رنگ مورد استفاده در این تحقیق اتیدیوم بروماید تهیه شده از شرکت سیناژن بود. مقدار ۳۰ میکرولیتر از رنگ با ۳۰۰ سی‌سی آب مقطر دو بار تقطیر مخلوط هم زده و ژل الکتروفورز به مدت ۲۰ دقیقه در آن قرار داده تا مراحل رنگ آمیزی انجام شود. رنگ اتیدیوم بروماید سرطانزا بوده و از ریختن آن درکف آزمایشگاه و یا تماس با پوست جداً خودداری گردد. و سپس شستشوی ژل در آب مقطر و سرانجام در دستگاه Gel documentation عمل عکسبرداری از ژل و ذخیره اطلاعات انجام می‌گردید.
این رنگ ساخته شده برای رنگ‌آمیزی ژل‌های متعددی می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد و نیازی به تعویض آن در هر بار رنگ‌آمیزی نمی‌باشد. همچنین قبل از قرار دادن ژل در تشتک رنگ‌آمیزی به خوبی آن را به هم زده تا رنگ در تمامی قسمت‌ها پخش گردد و باندها به طور یکسان رنگ‌آمیزی گردند. محل نگهداری رنگ در قسمتی تاریک و دور از نور آفتاب می‌باشد. از ریختن آب گرم بر روی رنگ بعد از تعویض و ریختن آن در سینک ظرفشویی جهت جلوگیری از ایجاد بخارات سمی اکیداً خودداری شود. پس از رنگ‌آمیزی مرحله شستشو در آب مقطر می‌باشد به مدت ۱۰ دقیقه ژل را از رنگ خارج و در آب مقطر جهت شستشو شدن قرار می‌دهیم و پس از گذشتن زمان مذکور آن را بر روی صفحه دستگاه ژل داک قرار داده و از آن عکس گرفته می‌شود. پس از انجام عکسبرداری و ذخیره کردن، ژل با دستکش درون پلاستیک قرار داده شده و در چاه مخصوص انداخته می‌شود.
۳-۸-توالی‌یابی (sequencing)
پس از اتمام PCR، محصولات PCR در فریزر۲۰- نگهداری گردیدند، سپس به همراه پرایمر به شرکت پیشگام ارسال گردید. محصولات PCR توسط این شرکت برای توالی‌یابی به کشور کره ارسال گردید. علاوه بر این برای اطمینان بیشتر توالی ژن مورد نظر در سایت NCBI بلاست گردید و صحت وجود ژن مورد نظر مورد تایید قرار گرفت.
۳-۹-۱- روش گرد آوری اطلاعات
میدانی: نمونه برداری از نمونه های ادرار مبتلا به عفونت ادراری
کتابخانه ای: انتخاب پرایمرهای مناسب جهت هدف قرار دادن ژن های ویرولانس
آزمایشگاهی: جداسازی ایزوله ها و شناسایی ژن های ویرولانس ابزار گرد آوری اطلاعات

بانک های اطلاعاتی مانند اینترنت
نشریات معتبر جهت دستیابی به مقالات مرتبط با موضوع
جمع آوری نمونه های ادراری به منظور جداسازی اشریشیا کلی
۳-۹-۲- روش تجزیه و تحلیل اطلاعات

1. 1. تکثیر توالی های اختصاصی (ژن های ویرولانس) با بهره گرفتن از تکنیک PCR

1. 1. تجزیه و تحلیل باندها (اثر انگشت با بهره گرفتن از نرم افزار Image lab

1. 1. بررسی آماری جهت تجزیه و تحلیل داده ها : از نرم افزار SPSS نسخه ۱۸ و همچنین جهت رسم

نمودارها و جداول از نرم افزار Microsoft Office Excel 2013 استفاده شد. مقایسه الگوهای باندی DNA مربوط به ویرولوتایپ ها با رویت و محاسبه نحوه قرارگیری آن ها در ژل بر اساس وزن مولکولی آن ها ومقایسه با مارکر مولکولی و شمارش باندها جهت هر نمونه صورت گرفت. یک ماتریکس صفر و یک به منظور وجود یا عدم وجود باند تهیه و در پایگاه اینترنتی ثبت شد و ویرولوتایپ ها بر پایه مشاهده ی نحوه قرارگیری آن ها در ژل براساس وزن مولکولی آن ها و مقایسه با مارکر مولکولی و شمارش باندها جهت هر نمونه انجام گرفت. شمارش سویه های واجد ژن ویرولانس و درصد گیری نسبت به کل نمونه ها مبنای درصد شیوع فاکتور ویرولانس می باشد.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴-۱- فراوانی بیماران بر اساس جنس
در مجموع از کل بیماران که مورد مطالعه قرار گرفتند ۱۸ مورد، ۱۸ درصد مذکر و ۸۲ مورد، ۸۲ درصد مونث بودند.(نمودار ۴-۱)
۱۸%
نمودار ۴-۱: فراوانی بیماران بر اساس جنس
بیماران بر اساس سن در ۴ گروه سنی(Age) شامل: کودک کمتر از یک سال، نوجوان، جوان و مسن تقسیم بندی گردیدند. ۴ مورد(۴%) در گروه سنی کمتر از یک سال، ۳ مورد (۳%) نوجوان، ۶۳ مورد(۶۳%) جوان و ۳۰ مورد(۳۰%) در گروه سنی افراد مسن قرار داشتند.(نمودار۴-۲)
%۳۰
%۶۳
%۳
۴%
نمودار۴-۲: فراوانی بیماران براساس سن(سال)
۴-۲-نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی
بررسی های ویرولوتیپینگ ایزوله های اشرشیا کلی که توسط تکنیک PCR انجام گردید نشان داد که ۹۸% از ایزوله ها متعلق به ژن Pap، ۹۵% از ایزوله ها متعلق به ژن aer ، ۹۴% ایزوله ها متعلق به ژن Fim، ۸۶% از ایزوله ها متعلق به ژن cnf ، ۶۳% از ایزوله ها متعلق به ژن Afa ، ۶۲% از ایزوله ها متعلق به ژن hlyA بودند. نمودار(۴-۳)
۹۵%
۶۲%