پس از آماده سازی و تنظیم pH محیط کشت و افزودن آنتی بیوتیک های مورد نیاز به آن، به وسیله فیلتر ۲۲/۰ میکرون و سرنگ استریل شد. جهت اطمینان از عدم وجود آلودگی احتمالی در محیط، نمونه ای از آن
در میکروتیوب استریل برای بررسی رشد میکروارگانیسم ها به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده و بقیه محیط در ظروف درپیچ دار استریل در ۴درجه سانتی گراد نگهداری شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

چون ال- گلوتامین و آنتی بیوتیک ها نیمه عمر کوتاهی در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد دارند و همچنین به دلیل احتمال آلودگی در دمای ۳۷درجه سانتی گراد نگهداری محیط کشت در یخچال الزامی است.
۳-۶ آماده سازی و افزودن سرم:
در این پژوهش از سرم جنین گاو (Biosera) استفاده شد. برای غیر فعال کردن کمپلمان موجود در آن، سرم را در بن ماری دمای ۵۶ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ دقیقه حرارت داده شد و سپس زیر هود به لوله های استریل انتقال داده شد و تا زمان مصرف در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شد. نقش سرم در محیط کشت تامین فاکتورهای رشد، هورمون ها و برخی اسید آمینه ها و پیش ساز های اسید نوکلئیک و اسید چرب می باشد.
۳-۷ روش تهیه PBS بدون کلسیم و منیزیم:
از این محلول عموما به عنوان بافر برای شستشوی سلول ها استفاده می شود. وجود نمک ها سبب تثبیت فشار اسمزی سلول ها شده و از لیز شدن آنها در زمان شستشو ممانعت می نماید. این محلول طبق فرمول زیر ساخته می شود:
NaCl₂ ۸ گرم
KCl 2/0گرم
Na₂HPO₄ ۱۵/۱ گرم
KH₂PO₄ ۲/۰گرم
آب مقطر دیونیزه ۱۰۰۰ میلی لیتر
نمک ها را در آب حل کرده، پس از تنظیم pH (7 – ۳ ) حجم نهایی را به یک لیتر رسانده با اتوکلاو استریل کرده، در ۴ درجه سانتی گراد نگهداری می شود.
۳-۸ محلول تریپسین- ورسن:
در این پژوهش از محلول تریپسین- ورسن برای جدا کردن سلول های متصل به کف پلیت استفاده شد. وجود کلسیم و منیزیم نقش مهمی در اتصال سلول های در حال تکثیر به سطح فلا سک دارند برای حذف این دو عنصر از محیط کشت سلول و جدا شدن بهتر سلول ها وجود EDTA در محلول تریپسین کمک قابل توجهی می کند. تریپسین یکی از اعضای خانواده اندوپپتیدازها می باشد و می تواند باقیمانده آرژنین و لیزین را هیدرولیز کند. این مواد به صورت آماده در قالب تجاری ۱۰۰X(Biosera) تهیه شد و چون محلول به صورت ۱X استفاده می شود آنرا در PBS رقیق کرده و سپس در حجم های ۱۰ میلی لیتر تقسیم و به صورت استریل در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شد.
۳-۹ منشا سلولی مورد استفاده:
سلول های Hela از سلول های سرطانی رحم انسان می باشد. از ویژگی این سلول تحمل تعداد پاساژ های زیاد و قدرت تکثیر بالا می باشد و برای تکثیر ویروس هایی نظیر هرپس سیمپلکس، روتا ویروس و … سلول مناسبی می باشد. سلول مورد استفاده در این تحقیق از بانک سلولی انستیتوپاستور ایران تهیه گردید.
۳-۱۰ تهیه کشت سلولی Hela :
در این پژوهش از سلول Hela جهت تکثیر HSV-1 استفاده گردید. برای کشت این سلول ها از فلاسک های پلاستیکی یکبار مصرف مخصوص کشت سلول با سطح ۲۵ سانتی متر مربع استفاده شد. تعداد ۱۰^۵ سلول به ازاء هر میلی لیتر از محیط کشت در نظر گرفته شد. بدین ترتیب برای فلاسک ۲۵ سانتی متر مربعی که به
۵ میلی لیتر محیط کشت نیاز دارد ۱۰^۵× ۵ سلول اضافه شد. سلول های Hela را در فلاسک مخصوص کشت سلول به همراه محیط DMEM که به آن ۱۰% سرم جنین گاو اضافه شده بود کشت داده و در انکوباتور CO₂ دار در ۳۷ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. این سلول ها با تکثیر پیاپی سطح فلاسک را پر کرده و یک منولایر کامل را تشکیل دادند.
۳-۱۱ حفظ و نگهداری سلول ها:
به منظور محافظت از کشت سلول روش های متفاوتی وجود دارد. یکی از آنها نگهداری سلول در ازت مایع یا در فریزر ۷۰- درجه سانتی گراد در مجاورتDMSO مخصوص کشت سلول و سرم جنین گاوی میباشد وجود DMSO مانع از لیز شدن سلول ها در دمای پایین می شود و روش دیگر پاساژ سلول ها در مواقع لزوم می باشد.
۳-۱۲ پاساژ سلول:
در مورد سلول Hela پس از پر شدن کامل سطح فلاسک کشت سلول و تشکیل منولایر کامل از سلول، در زیر هود بیولوژیک محیط را خارج کرده و به وسیله PBS استریل سلول ها را شستشو داده، سپس از تریپسین برای جدا شدن سلول ها از سطح فلاسک استفاده شد. بلافاصله بعد از آغاز جدا شدن سلول ها از سطح فلاسک، تریپسین را خارج کرده و با افزودن محیط کشت سلول و عمل پیپت کردن سلول ها، سوسپانسیون یکنواختی از آنها در محیط کشت بدست آمد. بعد از یکنواخت شدن سوسپانسیون سلولی ۲۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون فوق را برای شمارش سلولی در داخل لوله استریل قرار داده و بقیه در فلاسک مناسب کشت سلول انتقال داده شد. جهت دستیابی به کشت سلول مناسب لازم است تا در هر میلی لیتر سوسپانسیون سلولی۱۰^۵ × ۲-۱سلول وجود داشته باشد. سلول های Hela را می توان به راحتی با اضافه کردن بخشی از محیط DMEM حاوی ۱۰ درصد سرم تعویض محیط نمود.
۳-۱۳ تکثیر HSV-1 سویه KOS در سلول Hela:
در این تحقیق از ویروس هرپس سیمپلکس سویه KOS استفاده شد. ویروس فوق از دپارتمان ویروس شناسی دانشگاه تربیت مدرس تهیه گردید. پس از آنکه سلول های Hela حدود ۸۵% از سطح فلاسک را پوشاندند، محیط کشت از سطح سلول ها خارج گردید و سلول ها با محلول PBS مورد شستشو قرار گرفتند. به سلول های موجود در فلاسک، ۵۰۰ میکرولیتر از تعلیقHSV-1 تلقیح شد. فلاسک به آرامی تکان داده شد تا تمامی سطح سلول ها به سوسپانسیون ویروسی آغشته شود. برای کامل شدن جذب ویروسی درب فلاسک را بسته و به مدت ۱ ساعت در انکوباتور قرار داده شد و هر ۱۰ دقیقه فلاسک ها به آرامی تکان داده شدند تا جذب سلول بطور یکنواخت صورت گیرد. پس از اتمام زمان جذب، سلول ها مجددا با PBS شستشو داده شدند و سپس محیط کشت DMEM حاوی ۲% سرم جنین گاوی به سلول های فوق اضافه گردید و به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت تا ظهور آثار (CPE) Cytopathic Effect در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد نگهداری شد. پس از سپری شدن این مدت با مشاهده ۸۰ درصد CPE در منولایر سلولی، فلاسک به فریزر ۷۰- درجه سانتی گراد انتقال داده شد.
۳-۱۴ تعیین عیار ویروس به روش TCID50 :
قبل از استفاده از ویروس باید عیار آن مشخص گردد. بدین منظور از روش TCID₅₀( Tissue Culture Infective Dose 50) استفاده می شود. اساس این روش اندازگیری رقتی از تعلیق ویروسی است که بتواند ۵۰ درصد از کشت های سلولی تلقیح شده را آلوده کند. عیار ویروس به صورت دوز عفونی ۵۰ درصد یا TCID₅₀ بیان می شود.
در این تحقیق جهت تعیین تیتر ویروس ها از روش فوق استفاده گردید.
روش کار:
برای تعیین عیار ویروس مورد مطالعه از رقت های ویروسی با فواصل لگاریتمی ۱ استفاده شد.

1. 1. برای تهیه رقت های با فواصل ۱ log، از مخلوط ۸/۱ میلی لیتر DMEM بدون سرم به عنوان رقیق کننده و مقدار ۲/۰ میلی لیتر ویروس استفاده می شود و بدین ترتیب رقت هایی از ۱۰^-۱تا ۱۰^-۹از ویروس تهیه گردید.

1. 1. از هر رقت ۱۰۰ میکرولیتر به ۴ خانه از چاهک های میکروپلیت (۹۶ خانه ای) حاوی سلول از قبل آماده شده تلقیح شد.

1. 1. در هر میکروپلیت ۴ چاهک بدون تلقیح ویروس به عنوان شاهد سلول و ۴ چاهک با تلقیح ویروس رقیق نشده به عنوان شاهد ویروس در نظر گرفته شد.

1. 1. میکروپلیت به مدت ۱ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه گردید تا ویروس جذب سلول ها شود.

1. 1. به هر چاهک ۱۵۰ میکرولیتر محیطDMEM حاوی ۱% سرم افزوده شد و به انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد انتقال یافت.

1. 1. میکرو پلیت واجد سلول آلوده هر روز از نظر CPE کنترل شد و برای هر رقت از ویروس نسبت تعداد چاهک ها از هر رقت که CPE نشان داده اند به کل چاهک هایی که به یک رقت اختصاص داده شده اند در نظر گرفته شد.

1. 1. CPE تشکیل شده در هر چاهک به صورت ۰ و ۱ در نظر گرفته شد که هر کدام از این عدد ها به صورت زیر تعریف شدند:

۰: عدم حضور CPE در چاهک.
۱: حضور CPE در چاهک.

1. 1. قرائت نتایج تا روز سوم ادامه داشت.

1. 1. از رابطه Reed & Muntch با فرمول زیر برای تعیین عیار ویروس استفاده شد:

Log TCID50 = (log Dilution above 50%) + (proportinate distance × log Dilution factor)
۳-۱۵ عصاره گیاه مرزه:
در این تحقیق از گیاه satureja mutica L. استفاده شد بدین ترتیب که پس از تشخیص و تعیین گونه گیاه توسط کارشناسان موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور (برگهای گیاه) جدا و خشک گردید و سپس برگهای خشک شده آسیاب گردید و جهت استخراج عصاره آماده شد. بررسی عصاره گیری ابتدا پودر آسیاب شده گیاه از الکهای ۵۰۰ میکرونی عبور داده شد و سپس مقداری از پودر الک شده به ظرف شیشه ای تیره، انتقال داده شد و سپس عصاره گیری به روش خوابانیدن و با بهره گرفتن از حلال هیدروالکلی (مخلوط آب و متانول) صورت گرفت. بدین ترتیب که مقدار مشخصی از پودر آسیاب شده گیاه وزن شد ( ۲۷/۲۰ گرم) و به آن مقدار(۵۰ میلی لیتر) حلال که عبارت از مخلوط آب و متانول (۸۰ درصد الکل و ۲۰ درصد آب) بود، اضافه گردید و پس از گذشت چند ساعت عصاره توسط کاغذ، فیلتر شد و سپس با همان حلال به حجم (۵۰ میلی لیتر) رسانده شد. در مرحله بعد حجم مشخصی از عصاره (۲۰ میلی لیتر) در حرارت ۳۷ درجه سانتی گراد خشک شد و پودر مربوطه به دقت وزن گردید و مقدار ۵ میلی لیتر از محیط کشت DMEM که یک محیط کشت با پایه آبی می باشد به آن اضافه گردید و بعد از مخلوط کردن به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه یخچال قرار داده شد تا عصاره فوق کاملاً در محیط حل گردد. در مرحله بعدی این مایع از فیلتر ۲۲/۰میکرون عبور داده شد و بدین ترتیب وزن مشخصی از عصاره گیاهی در حجم مشخصی از محیط کشت بدست آمد و برای مراحل بعدی کار، غلظت های مختلف از عصاره از این ترکیب بدست آمده و مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۱۶ اندازه گیری آستانه سمیت عصاره بر سلول:
در ابتدا لازم بود که سمیت عصاره مرزه بر سلول های Hela بدون حضور ویروس تعیین گردد.